INTRODUCCIÓN

Los plátanos y bananos (Musa spp.) constituyen un alimento fundamental para más de 400 millones de personas alrededor de todo el mundo, donde ocupan el cuarto lugar dentro de los cultivos de mayor importancia a nivel mundial, solo superado por el trigo, el arroz y el maíz (Rustagi et al., 2019Rustagi, A., Shekhar, S., Kumar, S., Lawrence, K., Bhat, V. And Sarin, N. 2019. High speed regeneration via somatic embryogenesis in elite Indian banana cv. Somrani monthan (ABB). Vegetos, 9p.
).

En muchos países, es importante fuente de crecimiento económico e ingresos para muchas zonas rurales, al generar empleos y divisas (FAO y CELAP, 2020). En la actualidad los bananos son las frutas más consumidas en el mundo, considerados como cultivos estratégicos en la seguridad alimentaria de muchos países (Martínez-Solórzano y Rey-Brina, 2021Martínez-Solórzano, G.E. y Rey-Brina, J.C. 2021. Bananos (Musa AAA): Importancia, producción y comercio en tiempos de Covid-19. Agronomía Mesoamericana, 32(3):1034-1046. DOI:10.15517/am.v32i3.43610.
).

Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales en musáceas mediante yemas apicales de hijuelos, constituyen una de las prácticas más importantes de la biotecnología para la obtención de grandes volúmenes de plantas de plátanos y bananos libres de plagas y enfermedades fúngicas y bacterianas, así como para la propagación clonal de plantas sanas, por su estabilidad genética y en la conservación e intercambio de germoplasma (Ramírez et al., 2008Ramírez, M.; Lindorf, H. Y García, E. 2008. Cambios morfoanatómicos en los ápices del vástago y de la raíz del banano ‘Williams’ (AAA, Musa sp.) bajo distintas concentraciones de N6-benciladenina. The Journal of agriculture of tech University of Puerto Rico, 92(1-2): 53-73.
).

La conservación de la biodiversidad es estratégica para satisfacer las demandas crecientes actuales y futuras de la población mundial, de ahí que los bancos de germoplasma surjan como una respuesta a la necesidad de conservar el patrimonio genético vegetal, por lo que constituyen la base para una agricultura dinámica, diversificada y sostenida (Milián, 2018Milián, M.D. 2018. Recursos genéticos de la malanga del género Xanthosoma Schott en Cuba. Cultivos Tropicales, 39(2): 112-126.
).

Los bancos de germoplasma vienen a constituir una alternativa viable que nos permitirá conservar especies elites y a la vez multiplicar en el momento que se requiera para suplir las necesidades del sector agrícola del país. La propagación in vitro concede a los bancos de germoplasma la habilidad de multiplicar plantas en grandes cantidades cuando sea necesario. La conservación in vitro ha proporcionado resultados satisfactorios y ventajas para especies recalcitrantes o de propagación vegetativa que los bancos de campo no ofrecen (Reyes, 2016Reyes Román, G.A. 2016. Establecimiento de un banco de germoplasma de clones élite de banano (Musa spp.) cv. Williams, Valery (AAA) y plátano Barraganete (AAB) en condiciones de crioconservación. Trabajo de Diploma presentado para la obtención del título de Ingeniero Agrónomo. Universidad de Guayaquil. Facultad de Ciencias para el Desarrollo. Guayaquil, Ecuador. 56 pp.
). En las últimas décadas, las metodologías para especies tropicales incluyendo a las del género Musa, van en aumento, y las tasas de multiplicación son excepcionales (Basail et al., 2015Basail, M.; Medero, V.; Gutiérrez, Y.; Torres, M.; López, J.; Santos, A.; Rayas, A.; Bauta, M.; Beovidez, Y.; Ortega, A. 2015. Multiplicación in vitro de plátano vianda cv. ‘INIVIT PV-2011’ (Musa AAB) en Sistemas de Inmersión Temporal. Biotecnología Vegetal 15(3): 177-180
; Galán et al., 2018Galán, V.; Rangel, A.; López, J.; Pérez, J.B.; Sandoval, J. y Souza, H. 2018. Propagación del banano: técnicas tradicionales, nuevas tecnologías e innovaciones. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, 40(4): (e-574). DOI: 10.1590/0100-29452018574.
; Espinosa et al., 2020Espinosa, A.L.; Silva, J.J. y Caise, M. 2020. Multiplicación in vitro del clon de plátano ‘INIVIT PV 06-30’ (Musa spp.) en condiciones de biofábricas. REDEL. Revista científico-educacional de la provincia Granma, 16: 181-190.
).

En la conservación in vitro, el crecimiento del explante puede ser retardado reduciendo la temperatura y luminosidad, aplicando al medio retardantes químicos o reduciendo el nivel de oxigeno presente. Bajo estas condiciones, los intervalos de repique, pueden ser extendidos hasta un año o más (León-Lobos et al., 2010León-Lobos, P.; Seguel, I.; Condón, F. 2010. Conservación ex situ de los recursos fitogenéticos. En: Estrategia en los recursos fiogenéticos para los países del Cono Sur / IICA Montevideo: PROCISUR, IICA, 2010. 172p.
, Cisneros-Marrero et al., 2024Cisneros-Marrero, I.V.; C.L. Miceli-Møndez A.G. Rocha-Loredo, M.`. Peraltameixueiro Y M.A. Lpez-Miceli. 2024. Conservación in vitro a mediano plazo de vainilla (Vanilla planifolia Andrews; Orchidaceae). Polibotánica 57: 145-155 México. DOI: 10.18387/polibotanica.57.8é
).

La presente investigación se desarrolló con el objetivo de determinar las concentraciones de osmoreguladores en el medio de cultivo para la conservación in vitro de la Colección Cubana de Recursos Genéticos de Musa, conservada en el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), y así facilitar su uso e intercambio con otras colecciones del mundo.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se desarrolló en el laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT), Santo Domingo, Villa Clara, Cuba.

Se utilizó el cultivar de plátano ‘Burro enano’ (ABB), procedente de la Colección Cubana de Recursos Genéticos de Musa, mantenida en el Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT).

Para disponer de la cantidad necesaria de explantes para el montaje del experimento se multiplicó el cultivar objeto de estudio por organogénesis. El establecimiento in vitro de los ápices se realizó según López (1999)López, J. 1999. Genetic improvement of Musa spp. by in vitro mutational plant breeding. InfoMusa 8: 2-8.
. Las condiciones de cultivo fueron: temperatura 27 ± 2 ºC y régimen de 16 horas de luz (DFFF de 62-68 µmol m^-2s^-1) y ocho de oscuridad.

Una vez establecidos los ápices meristemáticos, se realizaron cuatro subcultivos con intervalos de 21 días. Se utilizó el medio de cultivo P5, constituido por las sales y vitaminas propuestas por Murashige y Skoog (MS) (1962)Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473-497.
, suplementadas con sacarosa (30 g L^-1), mioinositol (100 mg L^-1), ácido ascórbico (10 mg L^-1), ácido indolacético (AIA) (0,18 mg L^-1) y 6-Bencilaminopurina (6-BAP) (2,25 mg L^-1), el mismo fue gelificado con 6 g L^-1 de agar (Biocen) y ajustado a pH de 5,8 según López (2006)López, J. 2006. Nueva metodología para el desarrollo de la embriogénesis somática en el cultivar de plátano vianda ‘Navolean’ (Musa spp., grupo AAB). Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas, Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Avila. Ciego de Avila, Cuba, 100p.
. Las condiciones de cultivo fueron las mismas descritas para el establecimiento in vitro de los ápices.

Se utilizó como control el medio de cultivo de multiplicación del plátano (P5) (López, 2006López, J. 2006. Nueva metodología para el desarrollo de la embriogénesis somática en el cultivar de plátano vianda ‘Navolean’ (Musa spp., grupo AAB). Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas, Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Avila. Ciego de Avila, Cuba, 100p.
) y los tratamientos consistieron en tres concentraciones de sacarosa y tres de manitol combinadas como se detalla en la tabla 1.

Se aplicó un diseño completamente aleatorizado por entender homogéneas las condiciones de cultivo dentro de las cámaras y considerar como única fuente de variación los tratamientos. Para el análisis estadístico de los datos experimentales se empleó el Programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences) ver. 25.0 para Windows. Se comprobó el ajuste a la distribución normal de los datos de cada tratamiento (Kolmogorov-Smirnov) y la homogeneidad de las varianzas (Levene). Siempre que se encontró normalidad y homogeneidad de varianzas, con un nivel de significación de p<0.05, los datos se procesaron mediante análisis de varianza de clasificación simple y la comparación múltiple de medias se realizó según la prueba de Bonferroni por ser n diferente para los tratamientos.

Posteriormente, los cultivares seleccionados por grupos genómicos fueron colocados en el medio de cultivo determinado para la conservación in vitro y evaluados.

Para valorar la supervivencia y el desarrollo de los explantes ante las concentraciones de sacarosa y manitol se realizó una primera evaluación a los 35 días de incubados los explantes y posteriormente a los 126, 236 y 336 días de incubados los explantes en el medio de cultivo. Se evaluó:

Para evaluar la capacidad de recuperación del material conservado y su estabilidad genética mediante descriptores morfológicos, se subcultivaron los explantes conservados durante 11 meses a medio de cultivo de multiplicación (P5), seguidamente a medio de cultivo de enraizamiento y a los 30 días las plantas enraizadas, se transfirieron al ambiente ex vitro. En la fase de aclimatización, se utilizó como sustrato suelo y materia orgánica a base de cachaza en una proporción 3:1, en charolas de polipropileno de 70 alveolos. La siembra se realizó a 1 cm de profundidad, según la metodología propuesta por Pérez et al. (1999)Pérez, J.N.; Agramonte, D.; Jiménez, F. And Ramírez, D. 1999. Informe Final del Proyecto “Desarrollo y perfeccionamiento de la propagación masiva en las fases III y IV, enraizamiento y adaptación en caña de azúcar, papa, plátanos y bananos y adaptación de semillas artificiales en caña de azúcar”. IBP, Santa Clara, Cuba; 82p.
en una casa de cultivo cubierta por una malla plástica (zarán), que permitía el paso de una densidad de FFF de 600 µmol m^-2s^-1 (70%). El riego se realizó por microaspersión. Se garantizó una humedad relativa del 85-90%.

A los 21 días de la plantación se evaluó la supervivencia y a los 45 días la altura de la planta, número de hojas activas y la presencia de plantas con cambios fenotípicos, según la metodología propuesta por Sandoval et al. (1997)Sandoval, J.A.; Pérez L. And Côte. 1997. Estudio morfológico y de la estabilidad genética de plantas variantes de banano (Musa AAA cv. ‘Gran Enano’). Corbana 22(48), 41-60.
para el género Musa.

El procesamiento estadístico de los datos experimentales se realizó mediante un análisis de varianza (ANOVA). Para la comparación múltiple de medias se aplicó la prueba T de Student con un nivel de significación de p ≤ 0,05. Se evaluó en fase de aclimatización la ocurrencia de variaciones fenotípicas en las plantas obtenidas según López et al. (2018)López, J., Pérez, J. E., Rayas. A., Montano, N., Reinaldo, D., Y Medero, V. 2018. Aclimatización y evaluación en finca de producción del cultivar de plátano vianda ‘INIVIT PV-ENANO’ (Musa spp., AAB) propagado in vitro. Rev. Agricultura Tropical 4(1), 34-44
.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Al evaluar la supervivencia y el desarrollo de los explantes ante las concentraciones de sacarosa y manitol se pudo apreciar que altas concentraciones de sacarosa disminuyen la supervivencia del explante (Figura 1). Cuando se combina sacarosa con 20 g L^-1 de Manitol la disminución es considerable, mientras que al combinarla con 30 g L^-1 de Manitol disminuye la supervivencia con el aumento de la concentración de sacarosa, pero en menor medida.

De igual forma las altas concentraciones de sacarosa (60 g L^-1) incrementan el grado de oxidación fenólica del explante, mientras que al utilizar 30 g L^-1 de manitol se aprecia menor grado de afectación, en los tratamientos 4 (60 g L^-1 de Sacarosa + 20 g L^-1 de Manitol) y 10 (60 g L^-1 de Sacarosa + 40 g L^-1 de Manitol) los explantes no sobrevivieron a 100 días (Tabla 2).

Al evaluar las variables morfológicas grosor del pseudotallo, altura del explante y número de brotes se observa que los tratamientos estudiados de sacarosa y manitol en todos los casos disminuye el crecimiento con diferencias estadísticas con el testigo, que crece libremente en un medio de crecimiento (Tabla 3).

En los tratamientos 5 (30 g L^-1 de Sacarosa + 30 g L^-1 de Manitol) y 6 (45 g L^-1 de Sacarosa + 30 g L^-1 de Manitol) se aprecian los valores medios de altura, número de brotes y grosor del pseudotallo, con coloración verde intensa del explante y vitalidad que denota poder vivir en este medio de cultivo aun por más tiempo (Figura 2).

Hasta la evaluación realizada a los 236 días, los tratamientos 3, 5, 6 y 8 mostraron las mejores características morfológicas del explante.

Al evaluar el experimento a los 336 días se pudo corroborar que en el tratamiento 5, con 30 g L^-1 de Sacarosa y 30 g L^-1 de Manitol, se apreciaron las mejores características morfológicas del explante (tabla 4), y mejor recuperación de los mismos al subcultivarlos a un medio de cultivo de multiplicación, además un alto coeficiente de multiplicación.

Las plantas conservadas in vitro del cv. ‘Burro enano’ se multiplicaron y se pudo apreciar que se recuperaron perfectamente mostrando las características semejantes a las multiplicadas en medio de cultivo P5 de multiplicación (Tabla 5).

Al ser evaluadas en la fase de aclimatización a los 15 días se pudo apreciar que del tratamiento 5 se mantuvo el 100 % y el resto de los tratamientos con porcentajes superiores a 75% (Tabla 6), con buenas características morfofisiológicas y sin presencia de variantes fenotípicas.

A los 45 días se pudo apreciar que, en la altura de la plántula, número de hojas y coeficiente de multiplicación se observaron pocas diferencias entre los tratamientos, en todos los casos se mostraron buen desarrollo de las plántulas y no aparecieron variantes fenotípicas, solo el tratamiento con 30 g L^-1 de sacarosa y 30 g L^-1 de Manitol mostró diferencias estadísticas en los valores de la altura y el número de hojas (Tabla 5).

Los resultados obtenidos reflejan claramente el efecto de los reguladores osmóticos, la adición de estas sustancias reduce los potenciales osmótico e hídrico por lo que pueden disminuir la adsorción de agua y nutrientes del medio de cultivo. El potencial osmótico del medio de cultivo tiene efecto directo en los explantes, conforme sea más negativo, menor será la adsorción de agua y por consecuencia habrá una baja disponibilidad de nutrientes (Uribe, 2010Uribe Trimiño, A. 2010. Conservación in vitro por crecimiento mínimo de tres variedades de fresa (Fragaria x ananassa Duch). Tesis presentada en opción del título de Ingeniero Agrónomo. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Uruapan, Michoacán. México. 94 p.
).

Resultados similares obtuvieron Rayas et al. (2013)Rayas, A.; Cabrera, M.; Santos, A.; Basail, M.; López, J.; Medero, V.; Beovides, Y. 2013. Efecto del manitol y el nitrato de plata en la conservación in vitro de la malanga (Xanthosoma spp.). Revista Colombiana de Biotecnología XV(1): 167-171. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/28620.
en la conservación in vitro de Xanthosoma spp., y Rayas et al. (2025)Rayas, A.; Santos, A.; Basail, M.; López, J.; Medero, V.R.; Beovides, Y. 2025. Conservación in vitro de Colocasia esculenta (Araceae) bajo condiciones de crecimiento mínimo. Bionatura journal, 2(1):9. doi: 10.70099/BJ/2025.02.01.9. https://bionaturajournal.com/2025.02.01.9.html.
en Colocasia esculenta, donde se observó que al aumentar la concentración de manitol disminuye la altura, aumenta el número de brotes, disminuye el número de raíces, aumenta el número de hojas activas y disminuye la muerte de las hojas. Varios autores aseguran que el uso de osmorreguladores como el manitol, solo o combinado con otros, permite prolongar los periodos de subcultivo, y por ende la conservación efectiva de explantes, garantizando una tasa de crecimiento reducida del cultivo, así como un alto índice de supervivencia y viabilidad del material vegetal (Carmona et al., 2013Carmona, O.E.; Díaz, L.C.; Beltrán, J.D. 2013. Efecto de los osmolitos sacarosa, manitol y sorbitol en la conservación in vitro de Dioscorea alata, D. bulbifera, D. rotundata y D. trifida por el método de crecimiento mínimo. Rev. Asoc. Col. Cienc. (Col.) 2013, 25: 41-51 https://revistaaccb.org/r/index.php/accb/article/view/19.
y Rayas et al., 2025Rayas, A.; Santos, A.; Basail, M.; López, J.; Medero, V.R.; Beovides, Y. 2025. Conservación in vitro de Colocasia esculenta (Araceae) bajo condiciones de crecimiento mínimo. Bionatura journal, 2(1):9. doi: 10.70099/BJ/2025.02.01.9. https://bionaturajournal.com/2025.02.01.9.html.
). Esto puede estar dado porque las plantas no tienen una ruta nativa para la biosíntesis de los alcoholes de azúcar (manitol y sorbitol) por lo que es difícil asimilarlos. Sin embargo, una vez traslocados, pueden ser metabolizados y utilizados (Thorpe et al., 2008Thorpe, T.; Stasolla, C.; Yeung, E.C.; De Klerk, G.J.; Roberts, A.; George, E.F. 2008. The Components of Plant Tissue Culture Media II: Organic Additions, Osmotic and pH Effects, and Support Systems. In: Plant Propagation by Tissue Culture. Ed: George, E.G; M. A. Hall, Geert-Jan De Klerk. S 3rd Edition, volumen 1, ed: 115-175.
), reduciendo el metabolismo y crecimiento de la planta in vitro. Además, se señala que la adición de manitol disminuye el potencial osmótico del medio de cultivo, y reduce la absorción de nutrientes, afectando el crecimiento, pero altas concentraciones de manitol (superiores a 25 g L^-1) puede tener consecuencias desfavorables para el desarrollo del explante, que reducen el vigor, numero de brotes y sobrevivencia (Montiel-Castelán et al., 2016Montiel-Castelán, P.; Castillo-Martínez, C.R.; Gómez-Reyes, L.A.; Valle-Arizaga, M.; Jasso-Mata, J. 2016. Conservación in vitro por crecimiento mínimo de Swietenia macrophylla King, y Tectona grandis L. Agroproductividad 9(2): pp: 20-25.
).

Al analizar entre los genetistas la composición de la Colección Cubana de Musa conservada en el INIVIT, se seleccionaron los cultivares representativos por cada grupo genómico, al incubar estos cultivares en el medio de cultivo que contiene Sales y vitaminas recomendadas por Murashige y Skoog (1962)Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473-497.
, suplementadas con de 30 g L^-1 de sacarosa y manitol (Tabla 7), a los cuatro meses se pueden apreciar porcentajes de supervivencia superiores al 90% en todos los grupos, con el 100% de supervivencia en el grupo de los plátanos.

A los ocho meses de incubación se mantienen porcentajes por encima del 80% y a los 11 meses se aprecia disminución de la supervivencia, donde el grupo ABB muestra el menor valor (53,3%). Los cultivares de los grupos diploides y triploides AAA mantienen la mayor supervivencia (80 y 86%).

Se puede apreciar la diferencia entre los grupos genómicos, pero en general es posible utilizar el medio de cultivo para todos ellos. El medio de cultivo de crecimiento mínimo permite conservar tanto los genotipos tipo bananos como plátanos tipo vianda y tipo burro, ya sean diploides, triploides o tetraploides por encima de 11 meses de cultivo. Con un buen control de la desecación del medio de cultivo, disminución de la temperatura de incubación, los intervalos de subcultivos pueden ser prolongados. Así el medio de cultivo de crecimiento mínimo puede limitar las labores de cultivo y minimizar los costos del mantenimiento de germoplasma in vitro.

En la estabilidad genética de las plantas procedentes del cultivo in vitro, pueden influir varios factores. Dentro de éstos se encuentran: la variabilidad genética del cultivar o genotipo que va a ser propagado, la composición del medio de cultivo, la elección del explante que se utilizará, así como el grado de diferenciación de sus tejidos y el tiempo de permanencia in vitro del cultivo (Kumaravel et al., 2020Kumaravel, M., Uma, S., Backiyarani, S., Saraswathi, S.M. and Mayilvaganan, M. 2020. Antioxidant enzyme activities during somatic embryogenesis in Musa acuminata Colla (AAA group) “Grand Naine” and Musa spp. (AAB group) “Rasthali.” In vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. doi:10.1007/s11627-019-10017-3.
).

Para la conservación in vitro de los recursos genéticos se seleccionan plantas tipo de cada cultivar y el medio de cultivo con la menor cantidad de componentes que puedan causar variabilidad y como explante el ápice procedente de hijuelos tipo espada utilizado en la multiplicación convencional y que constituye un tejido poco diferenciado, se realizan pocos subcultivos (solo entre cuatro y cinco) antes de ser colocados en el medio de cultivo de crecimiento mínimo y se subcultivan solo cuando el porcentaje de supervivencia de los explantes conservados disminuye al 50%.

En los estudios realizados en la fase de aclimatización no se observaron variantes fenotípicas.

CONCLUSIONES

Se define que el medio de cultivo que contiene sales propuestas por Murashige y Skoog suplementado con 3% de sacarosa y 3% de Manitol es efectivo para el cultivo en crecimiento mínimo de Musa spp., los cultivares representativos de los grupos genómicos sobreviven por un año.

Los cultivares de los grupos genómicos AA, BB, AAB y AAAB exhiben los mayores porcentajes de supervivencias en el ciclo de cultivo (superior al 70%) y los del grupo ABB los porcentajes más bajos (53,3%).

BIBLIOGRAFÍA